Western blot, également connu sous le nom deimmunotransfert, est une technique bien établie et largement utilisée pour la détection et l'analyse des protéines. La méthode est basée sur la construction d'un complexe anticorps:protéine via une liaison spécifique d'anticorps à des protéines immobilisées sur une membrane et la détection de l'anticorps lié avec l'une de plusieurs méthodes de détection.
Bien que les détails deProtocoles de transfert Westernpeuvent varier d'une application à l'autre, avec des adaptations pour s'adapter aux caractéristiques spécifiques des protéines et au niveau d'information requis, ils suivent tous des étapes de base communes. Dans ce guide, nous explorerons ces sept étapes du transfert Western.
Saviez-vous: Décrite pour la première fois en 1979, la méthode de Western blot est depuis devenue l'une des méthodes les plus couramment utilisées dans la recherche en sciences de la vie.
Étape 1. Préparation de l'échantillon :
Le processus commence par l'échantillon d'intérêt subissant généralement un certain degré de traitement préliminaire avant de poursuivre la séparation par électrophorèse. Les matrices biologiques sont complexes. La protéine cible est probablement l'une des nombreuses protéines présentes dans l'échantillon, en plus des acides nucléiques, des polysaccharides et des lipides, qui pourraient tous interférer avec l'analyse.
De nombreuses méthodes sont disponibles pour perturber les cellules et préparer leur contenu pour analyse par Western blot. Utilisez des procédures d'extraction aussi douces que possible. Extraire les protéines rapidement, sur glace, si possible, en présence d'un tampon approprié pour maintenir le pH, la force ionique et la stabilité afin d'empêcher la dégradation des protéines. Il n'est généralement pas nécessaire de traiter les échantillons avant l'électrophorèse sur gel 1-D. Cependant, le nettoyage des échantillons améliore les performances en éliminant les composés potentiellement interférents tels que les acides nucléiques, les polysaccharides et les sels. NotreKit de nettoyage SDS-PAGEest conçu pour la préparation d'échantillons difficiles à analyser en raison de la présence de sels ou d'une faible concentration en protéines.
Étape 2. Électrophorèse sur gel :
L'électrophorèse est la deuxième étape, étape et est une méthode couramment utilisée pour séparer les protéines en fonction de la taille, de la forme et/ou de la charge. L'électrophorèse est une technique de séparation basée sur la mobilité de molécules chargées dans un champ électrique. Il est principalement utilisé pour l'analyse et la purification de grosses molécules telles que les protéines ou les acides nucléiques. Cela facilite ensuite le processus de sélection lors de l'examen des conditions qui vous permettront d'obtenir le plus efficacement possible le maximum d'informations dont vous avez besoin à partir de votre analyse spécifique.
L'électrophorèse est normalement réalisée en chargeant un échantillon contenant les molécules d'intérêt dans un puits d'une matrice poreuse (polyacrylamide) auquel une tension est ensuite appliquée. Des molécules de taille, de forme et de charge différentes dans l'échantillon se déplacent à travers la matrice à des vitesses différentes. A la fin de la séparation, les molécules sont détectées sous forme de bandes à différentes positions dans la matrice.
Lors de la sélection d'un gel, il est important d'utiliser une concentration d'acrylamide qui permettra une séparation optimale des protéines de votre échantillon. Les protéines de poids moléculaire élevé seront résolues de manière optimale dans des gels contenant une faible teneur en acrylamide, tandis que les protéines plus petites devraient idéalement être exécutées dans des gels plus denses en acrylamide. L'image montre le schéma de séparation de neuf protéines différentes pour chaque concentration d'acrylamide. Les marqueurs de poids moléculaire tels que leMarqueurs Amersham ECL™ Rainbowpeut être utilisé pour définir la taille des protéines exécutées dans un gel.
Étape 3. Transfert :
À la fin de la séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), l'étape suivante consiste à transférer les protéines du gel sur une membrane de support solide, généralement constituée d'une substance chimiquement inerte, telle que la nitrocellulose ou le PVDF. Le blotting permet de détecter les protéines sur la membrane à l'aide d'anticorps spécifiques. Les protéines transférées des gels sont immobilisées à leurs positions de migration relatives respectives au moment où le courant électrique de la course de gel a été arrêté. Les deuxMembranes Amersham Protran™ NC et Hybond™ PVDFoffrent une capacité de liaison aux protéines élevée, idéale pour une utilisation en Western blot.
Cliquez ici pour plus d'informations sur les différentes approches du transfert Western blot.
Étape 4. Sondage d'anticorps :
Une fois vos échantillons de protéines séparés et transférés sur une membrane, la protéine d'intérêt est détectée et localisée à l'aide d'un anticorps spécifique. Habituellement, les protocoles de transfert Western utilisent un anticorps primaire non marqué dirigé contre la protéine cible et un anticorps secondaire marqué spécifique à l'espèce dirigé contre la région constante de l'anticorps primaire. L'anticorps secondaire sert non seulement de support de l'étiquette mais est également un mécanisme pour amplifier les signaux émis, car de nombreux anticorps secondaires peuvent théoriquement se lier simultanément à l'anticorps primaire. C'est l'un des moyens les plus efficaces pour maximiser la sensibilité potentielle du test.
Pour cette raison, les anticorps secondaires sont le plus souvent polyclonaux et peuvent cibler des épitopes sur les régions de charpente de l'anticorps primaire ; la spécificité est donc limitée à l'espèce et à l'isotype d'immunoglobuline. Le signal émis par l'anticorps secondaire marqué est alors mesuré et est proportionnel à la quantité de protéine d'intérêt présente sur la membrane. Blocage avec BSA ouRéactif de blocage Amersham ECL™est une première étape importante avant le sondage des anticorps pour éviter la liaison non spécifique des anticorps aux membranes. Les anticorps secondaires sont généralement soit conjugués àCyDyeMCpour la détection fluorescente ou à la peroxydase de raifort, comme laAnticorps conjugués Amersham ECL™ HRPpour la détection basée sur la chimioluminescence.
Étape 5. Détection :
Les réactifs radio-isotopiques et chromogéniques sont largement utilisés depuis de nombreuses années, mais leur popularité a diminué en raison de problèmes de sécurité liés à la manipulation d'isotopes radioactifs et d'une faible sensibilité aux réactifs chromogéniques. La chimioluminescence et la fluorescence sont désormais les deux méthodes de détection les plus couramment utilisées en Western Blot. Les réactifs radio-isotopiques et chromogéniques sont largement utilisés depuis de nombreuses années, mais leur popularité a diminué en raison de problèmes de sécurité liés à la manipulation d'isotopes radioactifs et d'une faible sensibilité aux réactifs chromogéniques. Les méthodes de détection enzymatique, telles que la chimiluminescence nécessitent l'ajout d'un réactif qui émet de la lumière lorsqu'il réagit avec une enzyme (HRP) conjuguée à un anticorps secondaire. Des efforts considérables ont été faits pour développer des réactifs de détection à base de HRP tels queAmersham ECL™ PrimeetECL SelectMCafin d'obtenir une sensibilité de détection plus élevée, une intensité lumineuse plus forte et des signaux de longue durée.
La détection basée sur la fluorescence, en revanche, ne nécessite aucun réactif supplémentaire après la liaison de l'anticorps secondaire marqué. Les systèmes de détection basés sur la fluorescence utilisent une entité fluorescente, ou fluorophore, directement conjuguée à un anticorps ou à la streptavidine. Le fluorophore peut être excité à l'aide d'une source lumineuse d'une longueur d'onde spécifique provoquant une émission de lumière.
Au lieu d'ajouter un réactif de détection, les signaux fluorescents peuvent être directement détectés avec des équipements, tels que des scanners laser, équipés de sources lumineuses et de filtres d'émission appropriés.Amersham ECL Plex™utilise Cy™3 et la détection basée sur Cy™3. alors queAmersham CyDye™ 700 et 800utilise la détection basée sur le NIR qui gagne en popularité ces dernières années. La détection basée sur la fluorescence permet également le multiplexage où plusieurs cibles protéiques peuvent être détectées sur le même blot. La détection basée sur la fluorescence facilite également la réalisation de la normalisation totale des protéines à l'aide deTeinture rapide Amersham™.
Étape 6. Imagerie :
La dernière étape du workflow de transfert Western avant l'analyse des données est la capture d'image. La chimiluminescence améliorée (ECL™) est basée sur la réaction entre un substrat de luminol ajouté et des anticorps marqués à la peroxydase de raifort (HRP). En présence de HRP, le peroxyde d'hydrogène catalyse l'oxydation du luminol, réaction qui se traduit par l'émission de lumière. Le signal lumineux chimiluminescent peut alors être détecté surFilm radiographiqueou par imagerie numérique avec un imageur basé sur une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD) tel que leAmersham ImageQuant™ 800.
Lors de l'utilisation de la détection par fluorescence, un fluorophore est conjugué à l'anticorps primaire ou secondaire. La lumière est émise par le fluorophore après excitation via une longueur d'onde spécifique de lumière. Cela peut être détecté par des imageurs à base de CCD tels que leAmersham ImageQuant™ 800ou avec des scanners laser très sensibles tels que leAmersham Typhon™.
Analyse:
La détection de signaux à l'aide de l'imageur CCD Amersham ImageQuant™ 800 ou du scanner laser Typhoon™ produit une ou plusieurs bandes de protéines visibles sur l'image de la membrane. Le poids moléculaire de la protéine peut être estimé par comparaison avec des protéines marqueurs et la quantité de protéine peut être déterminée car elle est liée à l'intensité de la bande (dans les limites du système de détection).
Dans la plupart des applications, il suffit de confirmer la présence de protéines et d'estimer approximativement la quantité. Cependant, d'autres applications exigent une analyse quantitative qui définit les niveaux de protéines en termes relatifs ou absolus. Pour cela leImageQuant™ TLLe logiciel offre la gamme complète d'outils d'analyse nécessaires pour quantifier avec précision les protéines sur le blot. LeLogiciel IQTLest également disponible pour les environnements réglementés (IQTL SecurITy) pour permettre la traçabilité des données.
